天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究

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细胞总传代次数按 ∑log 2（ D/Do/R）计算，D、Do 分别为收获和接种时的细胞密度，R 为细胞贴壁率； 细胞平均传代速度按公式（传代次数-28）/周数计算，细胞传代后如 3 周内不能融合，定义为细胞复制性衰老终末。

1.2.5 细胞增殖活度的检测——MTT 法测定 将第 52 代 MRC-5 细胞以每孔 1.0×104/mL 的密度接种于 96 孔板，200 L / 孔，常规培养 20 h，待细胞贴壁后，更换不同含药血清培养液 200 L / 孔，分别于培养 48 h 后，加 入 0.5% MTT 溶液 50 L，置 37℃ ，5 % CO2 条件下 4 h，出现蓝色结晶后，弃上清，PBS 洗 1~2 次，加入 DMSO 150 L / 孔，室温轻柔震摇 2~3 min 以充分溶解结晶，用酶标仪于 490 nm 测 A（OD） 值。

1.2.6 衰老细胞数的检测 将各组 MRC-5 细胞接种于盖玻片上，经干预处理后，PBS 洗 1 次，用 40 g/L 多聚醛固定细胞 45 min，用 X - 半乳糖苷酶（X-Gal）染液（含 20 mmol/L X-gal、40 mmol/L 醋酸-磷酸钠（pH 6.0）、5 mmol/L 铁氰化钾、5 mmol/L 亚铁氰化钾、150 mmol/L 氯化钠、2 mmol/L 氯化镁），37℃ 保温 4~8 h，然后用双蒸水冲洗 2 次，再固定 4 min（固定液：体积分数为 70% 乙醇、福尔马林、冰醋酸按 20:2:1 比例混合），流水轻轻冲洗，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。细胞胞浆染成青绿色的为衰老的阳性细胞，每张片子镜下计数 400 个细胞，确定 X-Gal 染色阳性衰老细胞数的百分比。

1.3 统计学处理

实验结果以数据和图表表示，测定值以均数±标准差（x±s）表示，采用 SPSS 8.0 软件包分析，两组比较采用 student t 检验，多组间均数比较用单因素方差分析，以 P < 0.0 5 为存在统计学显著性差异。
2 结 果

2.1 天然脑活素对细胞表型的影响

由图 1 可见，年轻组细胞呈梭性或长梭形，核仁清晰，胞浆折光性强，细胞融合速度快，细胞排列整齐有序；复制性衰老细胞形态变异，胞体扁平宽大不规则，核仁不明显，细胞排列凌乱无序，胞浆内颗粒累积，出现空泡，细胞融合速度减慢；天然脑活素处理组细胞老龄化程度不明显，细胞形态变化不大，而与年轻细胞相似。将已经出现衰老表型的老龄细胞转入含天然脑活素的 EMEM 中继续培养 24~72 h，细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但未见完全逆转。

2.2 天然脑活素对 MRC-5 细胞代龄和传代速度的影响

含天然脑活素血清的培养基连续培养 MRC-5 细胞，与用含同体积空白对照血清的培养基培养的 MRC-5 细胞进行对比，结果发现天然脑活素低、中、高剂量组细胞的代龄显著高于空白老龄对照组细胞。天然脑活素培养的细胞传代速度亦明显快于老龄对照细胞（见表 1）。

2.3 天然脑活素对细胞增殖活度（MTT 值）的影响

分别用空白对照血清和天然脑活素血清培养第 50 代 MRC-5 细胞 48 h 后，应用 MTT 法检测细胞的增殖能力。结果发现天然脑活素培养的细胞增殖活度明显高于空白老龄对照组细胞（P < 0.05），且随浓度增加而升高；与年轻细胞无显著性差异（P > 0.05） 。 提示，天然脑活素可促进 MRC-5 细胞的生长增殖（见表 2）。

2.4 天然脑活素对 MRC-5 细胞衰老细胞数目的影响

天然脑活素作用于衰老成纤维细胞一定时间，固定后用 X-gal 染色检测其 β- 半乳糖苷酶活性。 SA-β- 半乳糖苷酶染色阳性细胞的胞浆染为青绿色，空白老龄对照组细胞 SA-β- 半乳糖苷酶染色阳性细胞数远远高于年轻组细胞，而天然脑活素处理细胞组阳性细胞数较空白老龄对照组显著降低（P < 0.01），见表 2。提示，天然脑活素可下调 MRC-5 细胞 SA-β-半乳糖苷酶的表达，抑制细胞衰老，延长细胞寿命。

3 讨 论

绝大多数正常人类细胞在体外组织培养的序列传代过程中，逐渐丧失其增殖传代的能力，最终达到一种不可逆的增殖停滞状态，并可保持代谢活力的稳定，能够维持数月甚至数年。这种似乎是无限期的增殖停滞状态被命名为衰老（senescence），而细胞达到衰老状态时的传代次数称为寿限[1，2]。衰老是由细胞所经历的传代次数决定的，而与时间无关。体外细胞的衰老与体内组织的衰老有直接的相关性[3，4]

人二倍体成纤维细胞（human diploid fibroblasts, HDFs）一般没有端粒酶活性，所以当端粒 DNA 长度丢失达到临界长度时，染色体变形急剧增加，染色体间发生融合， 细胞不再增殖，从而导致细胞衰老、死亡[5]，故常常被作为衰老研究的理想模型。衰老细胞除了不能复制传代之外，还表现出一系列生理学、形态学和多种分子生物学的改变，如形态大小不规则，胞浆内颗粒性物质累积，细胞排列散乱，培养基中多见细胞碎片，细胞失去融合能力、缝隙连接减少等[6-8]。

笔者以在体外只能进行有限次数分裂的人胚肺成纤维细胞（MRC-5）制备复制性衰老细胞模型，研究天然脑活素延缓衰老的作用及机理。实验发现，天然脑活素培养的细胞在老年阶段未见上述衰老表型，将已出现衰老样改变的细胞转入天然脑活素培养基中继续培养，细胞的衰老表型出现一定程度的改善，但尚未见完全逆转，上述结果提示：天然脑活素能够维持 MRC-5 的非衰老表型。

细胞寿命常以体外培养时细胞传代次数表示。本研究结果显示，低剂量、中剂量、高剂量天然脑活素的 EMEM 培养的 MRC-5 细胞平均传代次数，显著高于老龄对照细胞；天然脑活素培养的 MRC-5 细胞传代速度也快于老龄对照细胞。提示天然脑活素可显著增加细胞寿命，其可能促进了细胞的增殖速度，这一结论被 MTT 实验进一步证实。

天然脑活素作用于正常衰老型成纤维细胞，通过测定衰老细胞的百分比，与老龄对照组细胞相比衰老细胞数目明显减少，衰老细胞百分比显著降低，提示天然脑活素可延缓衰老细胞的群体死亡的发生，从而延长细胞的体外寿命。

总之，本研究通过对细胞形态学、细胞寿命、细胞增殖活度、衰老细胞百分比等指标的研究，初步证实天然脑活素可通过促进细胞增殖速度，进而延缓 MRC-5 细胞的复制性衰老，为中药延缓衰老开辟了新的研究途径。关于天然脑活素对端粒酶活性、细胞端区缩短速率、基因损伤与修复能力以及衰老主导基因的表达的影响，本室正在进一步研究中。

【参考文献】
〔1〕Miller RA. The aging immune system: primer and prospectus 〔J〕. Seience, 1996, 273:70-74

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