天然脑活素促细胞增殖和抗细胞衰老作用的研究

【摘要】 目的：探讨天然脑活素对人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）增殖能力和复制性衰老的影响及其机理。方 法： 光镜下观察 MRC-5 细胞衰老表型，常规计数细胞代龄、传代速度， MTT 法检测细胞增殖活度，X-Gal 染色法观察细胞衰老情况，计数衰老细胞百分率。 结果：天然脑活素可维持细胞的非衰老表型，增加 MRC-5 细胞代龄，天然脑活素 孵育 MRC-5 细胞的细胞增殖能力较空白老龄对照组明显升高（P ＜ 0.05），细胞的增殖速度显著加快。另外，天然脑活素连续培养的细胞在老龄阶段衰老细胞数显著低于老龄对照细胞（P ＜ 0.01）。 结论：天然脑活素可升高 MRC-5 细胞增殖能力，有效延缓细胞的复制性衰老。

【关键词】 天然脑活素； 人胚肺成纤维细胞；增殖活度；复制性衰老；延缓

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Natural Cerebrolysin on cell proliferation activity and replicative senescence of human embryonic lung diploid fibroblasts (MRC-5 cells) and its mechanism. Methods To observe the changes of senescent phenotype by light microscope, count the passage ages and velocity, detect the potential of cell proliferation by MTT. The changes of cells senescence of Natural Cerebrolysin-effected MRC-5 cells were studied by X-Gal staining method, and the positivecell rates of senescence cells were detected and analyzed.． Results Natural Cerebrolysin maintainedunaltered cell morphology and increased life span of MRC-5 by at least 18-21 passages. Comparing withthe control senium cells, the proliferation potential of MRC-5 cells incubated with Natural Cerebrolysin was increased obviously (P < 0.05), and the passage velocity was enhanced double of that of the controlsenium cells (P < 0.01). In addition, the positive cell rate of senescence cells was significantly lower in late passage cells in sequenced multigeneration culture in Natural Cerebrolysin than those of control senium cells (P < 0.01), and similar to those of young cells. Conclusion As a result, we concluded that Natural Cerebrolysin could notably promote the proliferation activity of MRC-5 cells and delay the cells replicative senescence efficiently.

〔Key Words〕 Natural Cerebrolysin; Human embryonic lung diploid fibroblasts; Proliferation activity; Delay; Replicative senescence

衰老（senescence）是细胞的重要生命现象之一，绝大多数正常细胞被认为仅有有限的分裂能力，当其经过一定的倍增之后，将进入终末增殖状态，称为细胞衰老。一般来讲，人类胚胎的成纤维细胞在达到衰老时，能够复制 50 代左右（Population Doublings, Pds），由于这种衰老是由分裂传代而达到的，故又称之为复制性衰老（replicative senescence）[1]。探讨细胞衰老的分子机理是人类认识自我研究的重要组成部分，从分子水平研究衰老过程中基因及调控变化，已成为目前衰老机理研究的主要方向，同时研究开发延缓衰老的药物将为提高人类生存质量提供重要保证，也为衰老相关疾病的防治提供理论基础和实验依据。

天然脑活素为结合临床经验和现代药效学正交实验优化筛选而成，本研究在以往基础上以人胚肺二倍体成纤维细胞（MRC-5）为研究对象，观察了天然脑活素对 MRC-5 细胞表型、细胞代龄、传代速度、细胞生长增殖能力及衰老相关指标的影响，旨在探讨其延缓 MRC-5 细胞复制性衰老的作用及其机理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株与动物 MRC-5 细胞是人胚肺成纤维细胞，由美国 ATCC 细胞库提供（ATCC No: CCL-171），并规定 28 代及以下为年轻细胞，50 代及以上为老年细胞，采用含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养液培养。

新西兰家兔，雄性，体重（1.5±0.2）kg，购自广东省医学实验动物中心，经 1 周的适应性饲养之后进行实验。

1.1.2 药品及试剂 研究用药天然脑活素由深圳市中西医结合临床研究所进行生药鉴定并由西安杨森制药厂制备成临床安全级粉剂，纯度为 98%。中国论文网真诚为您提供医学论文发表。

胎牛血清、EMEM 培养基购自美国 Gibco 公司。MTT 购自 Sigma 公司。β- 半乳糖苷酶细胞化学染色试剂盒购自美国 KPL 公司。其他试剂均为国产分析纯级。

1.1.3 主要仪器 BIO-RAD 680 型酶联免疫检测仪（USA），Leica DM16000B 型图象分析系统（Germany），SANYO MCO-15AC 型二氧化碳培养箱（Japan）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 共分 5 组，年轻对照组；空白老龄对照组；天然脑活素低剂量组；天然脑活素中剂量组；天然脑活素高剂量组，年轻对照组和空白老龄对照组以含 10% 正常空白血清的 EMEM 培养，天然脑活素低、中、高剂量组分别以含 2.5%、5%、10% 天然脑活素含药血清的 EMEM 培养液培养，血清含量不足 10% 的用正常空白血清补充。

1.2.2 实验含药血清的制备 含药血清的制备：将雄性新西兰家兔随机分为天然脑活素灌胃组、空白对照灌胃组，每组 6 只，根据成人治疗量换算为家兔用量灌胃。每个家兔每天灌药量相当于上述配成的成药液 2~3 mL 。连续灌胃 1 个月，末次给药后 2 h 内后行颈动脉采血，离心分离血清，无菌过滤，56℃ 灭活补体，即为含药血清，10 mL分装后 -70℃保存备用。正常对照空白血清的制取是在灌胃相同体积的生理盐水及相同的时间后，用同样方式提取分离保存。

1.2.3 细胞培养 人胚肺二倍体成纤维细胞 MRC-5 采用加入双抗的含 10% 胎牛血清（FBS）的 EMEM 培养液培养，在饱和湿度、37℃ 、5% CO2 常规培养条件下培养，当细胞融合度约 90% 时，按照 1:3 或 1:4 传代。

1.2.4 细胞计数和细胞形态学检查 从第 30 代起，天然脑活素低、中、高剂量组、及空白老龄对照组细胞分别以含 2.5%、5%、10% 天然脑活素含药血清及 10% 正常空白血清 EMEM 培养液代替含 10% FBS 的 EMEM 培养液继续培养传代。光镜下跟踪观察细胞形态大小、胞浆折光性、浆内颗粒大小和密度以及细胞排列情况。

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