牡蛎酶解液的抗氧化活性研究

【摘要】 目的探讨牡蛎酶解液的抗氧化活性。方法用普鲁士蓝反应法测定牡蛎酶解液还原能力，在DPPH体系、Fenton体系和邻苯三酚自氧化体系中分别检测牡蛎酶解液清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）、羟基自由基（·OH）和超氧阴离子（O2―·）的能力，并考察牡蛎酶解液在Fe2+诱发卵黄脂蛋白过不饱和脂肪酸（PUFA）过氧化体系中的抗氧化作用。结果牡蛎酶解液清除DPPH·和·OH的EC50分别为7.313和1.330 mg/ml；牡蛎酶解液（17.800 mg/ml）对超氧自由基和卵黄脂蛋白脂质过氧化的抑制率分别为19.86%和82.97%。结论牡蛎酶解液具有显著的清除DPPH·和·OH作用，且活性与剂量呈正相关，并对卵黄脂蛋白脂质过氧化也显示出了较强的抑制作用。

【关键词】 牡蛎 酶解 自由基 抗氧化

现代医学研究表明，适量的自由基在免疫反应、细胞分化、细胞凋亡和其它生化代谢过程中起着重要的作用，然而过量的自由基则在机体中引起一系列生物学反应，导致组织细胞、亚细胞和分子结构的破坏，并随着破坏层次逐渐扩展造成功能损伤，引起心血管疾病、癌症和衰老等，它是构成很多疾病的病理学基础。因此合理地使用抗氧化剂可以有效地预防和治疗某些疾病，延缓衰老。

合成抗氧化剂往往具有一定的毒副作用，使得它们的使用受到严格控制。而天然抗氧化剂副作用较小，因此，寻找高效、价廉、低毒甚至无毒的天然抗氧化剂的工作备受人们关注。目前，抗氧化活性肽是天然抗氧化剂研究热点之一，而且现在大部分抗氧化活性肽是通过蛋白酶在温和条件下水解蛋白质而获得，食用安全性高，比较符合现代人所追求的健康饮食的理念。

牡蛎（oyster）俗称海蛎子、蚝等，是世界上第一大养殖贝类，也是我国四大养殖贝类之一。牡蛎肉的主要营养成分为蛋白质和糖原，含量分别为50.63%和22.41%；其氨基酸组成完善，8种必需氨基酸含量占氨基酸总量的40%，而且还含有丰富的牛磺酸。此外，牡蛎肉中还含有多种矿物质和微量元素，其中锌和硒的含量丰富［1］。我国牡蛎资源丰富，且其蛋白质含量高，是采用酶解法制备生物活性肽的良好原料。本文就牡蛎酶解液的抗氧化活性进行全面地评估，为我国的牡蛎资源充分开发利用奠定基础。

1 材料与仪器

1.1 材料牡蛎（购于南宁海鲜批发交易市场）；胰蛋白酶（1：250，牛胰，Amresco分装）；二苯代苦味酰基(DPPH，1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，购自Sigma公司)；番红O（Safranin O，AMRESCO，上海生工生物工程有限公司）；2-硫代巴比妥酸（生化试剂，国药集团化学试剂有限公司）；铁氰化钾、硫脲、H2O2 、EDTA二钠盐、焦性没食子酸等均为国产分析纯。

1.2 仪器LAMBDA BIO 20型紫外-可见分光光度计（美国PE公司）；DS-1高速组织匀浆机（上海标本模型厂）；TOMY RS-20Ⅱ型高速冷冻离心机（TOMY SEIKO CO.,LTD）；HH-W600型三用恒温水箱（江苏省金坛市医疗仪器厂）。

2 方法

2.1 牡蛎酶解液的制备［2］新鲜牡蛎去壳、洗净，得新鲜牡蛎肉，按料水比1∶3（mg∶ml）比例加入预冷的双蒸水，高速匀浆，加酶量为2％，在pH 8.0（用0.2N NaOH调节），45℃条件下，酶解6 h后，沸水浴灭活10 min，冷却，最后以7 000～8 000 r/min，4℃离心30 min，取上清液分装，即得牡蛎酶解液，冷藏备用。

牡蛎酶解液的蛋白含量测定采用Folin-酚试剂法［3］。

2.2 牡蛎酶解液还原能力的测定［4］采用普鲁士蓝反应法测定牡蛎酶解液的还原能力。其原理为：

K3Fe (CN)6 + 样品 → K4Fe (CN)6 + 样品氧化物

K4Fe (CN)6 + Fe3+ → K4［Fe (CN)6］3 (蓝色)

在波长700 nm条件下测定吸光值A(A越大，则样品的还原能力越强)。中国论文网为您提供医学类论文。

取不同浓度的牡蛎酶解液稀释液（3.625，7.250，10.875，14.500，18.125 mg/ml）1.0 ml，再加入0.2 mol/L，pH6.6的磷酸盐缓冲液1.0 ml及1%的铁氰化钾〔K3 Fe（CN）6〕溶液1.0 ml，于50℃水浴反应20 min后急速冷却，再加入质量分数为10%的三氯乙酸(TCA)溶液1.0 ml，振荡均匀后，3 000 r/min离心10 min，取上清液2.5 ml，加入蒸馏水2.0 ml及质量分数为0.1%三氯化铁溶液0.5 ml，混合均匀，静置10 min后于700 nm测定其吸光值。

2.3 牡蛎酶解液在DPPH体系中抗氧化性的测定［5］DPPH·(二苯代苦味酰基自由基)在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其结构中含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517 nm有强吸收。有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸收度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的，因此可用与检测自由基的清除情况，从而评价实验样品的抗氧化能力。

取不同浓度的牡蛎酶解液稀释液（1.780，3.560，5.340，7.120，8.900 mg/ml）2 ml，加入1×10-4 mol/L DPPH无水乙醇溶液 2 ml，混匀后在室温下避光反应30 min，在517 nm下测定吸光度Ai，空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。

清除率计算：清除率(%) = ［1－ (Ai－Aj)／A0］ ×100%

式中：A0-对照组吸光度；Ai-样品组吸光度；Aj-空白组吸光度。

2.4 牡蛎酶解液在Fenton体系中抗氧化性的测定［6］在Fenton反应体系中，·OH由EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)-H2O2产生，由于·OH可特异性地使番红O（Safranin O）褪色,根据褪色程度用比色法来衡量·OH的含量。

取0.15 mol/L，pH 7.4的磷酸缓冲液1.5 ml，110μg/ml的番红溶液0.2 ml，2 mmol/L的EDTA-Na2-Fe(Ⅱ) 0.7 ml，再分别加入不同浓度的样品溶液0.8 ml，最后加入体积分数为1.5%的H2O2 0.8ml以启动反应，混匀后于37℃水浴保温30 min，在波长520 nm处测吸光度A。空白组以等体积的去离子水代替样品溶液；对照组以等体积的去离子水代替样品溶液和EDTA-Na2-Fe(Ⅱ)溶液。清除率E (%)按下式计算,并以羟基自由基特异性清除剂—硫脲作阳性对照。

E (%) = (A样品－A空白)/(A对照－A空白)×100%

式中：A样品-样品组吸光度；A空白-空白组吸光度；A对照-对照组吸光度。

2.5 牡蛎牡蛎酶解液在邻苯三酚体系中抗氧化性的测定［7～9］邻苯三酚在弱碱性（Tris-HCL缓冲溶液pH为8.20)环境中自身氧化分解产生O-2·和有色中间物(在320 nm处有最大吸收峰)，O-2·对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生成量的多少，可判断O-2·生成量的多少。也由此出现的一系列颜色变化，可以利用分光光度法进行测定。当有抑制剂存在时，可清除氧自由基，从而阻止中间产物的积累，根据吸光度数值的变化可求出抗氧化剂的活性。

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